利用哺乳动物细胞重组卵白药物和抗体是生物制药工业的主要方向（宝生物）动物细胞表达制备药用卵白的研究进展，

 

50%以上使用悬浮培养细胞，约70%药用卵白用CHO细胞生产，如CHO细胞能在10000L以上的生物反应器中高密度、无血清悬浮培养，单个工程细胞每天卵白表达量达20pg，分批补料式生物反应器悬浮培养细胞密度达2000万/mL以上，卵白产量高达10g/L(张国强等，2005)。

Vero细胞系是由日本学者从非洲绿猴(Cercopithecusaethiops)的肾脏组织中分离培养出来的上皮样细胞，该细胞系取“VerdaReno”(世界语意为绿色的肾脏)的简写而命名为“Vero”。

Vero细胞在体外培养时通常以二维单细胞层在含有血清的培养基中贴壁生长(Kimetal.，2012)。

现代疫苗及重组卵白药物生产中已广泛使用诸如MDCK、BHK-21、CHO以及Vero等永生化细胞系，这些细胞系能够连续产生较高的病毒滴度(Pauetal.，2001)。

Vero细胞可以用于呼肠孤病毒(Reoviruses)、腺病毒(Adenovirus)、犬细小病毒(Canineparvovirus)、猫粒细胞缺乏症病毒(

Felineinfectiousagranulocytosisvirus)、禽流感病毒(Avianinfluenzavirus)多种病毒繁殖和纯化，是生产兽用疫苗的优良细胞株(Frahmetal.，2003)。

差别于CHO、HEK293、BHK等在驯化过程中很容易失去粘附性能的贴壁依赖性细胞系，Vero细胞培养过程中紧密连接卵白的形成与血清无较大关系，粘附能力受钙、镁离子的影响较弱，而且培养过程中存在很严重的“失巢凋亡”现象(Anoikis)(尚立娜等，2019)，故用传统的悬浮驯化手段很难得到稳定的悬浮型细胞。

近年来，基因修饰技术和无血清培养基细胞筛选技术已乐成应用于悬浮细胞株的构建与筛选驯化，使细胞增殖、细胞活力、表达量等方面得到有效提高，已在多种病毒疫苗生产中得到广泛应用。

利用基因工程的方法构建悬浮型Vero细胞，需要筛选与Vero细胞粘附功能所需的卵白质，并了解这些卵白质如何影响细胞粘附性能。

差别的组织和细胞可能表达差别的粘附卵白，粘附卵白具有组织特异性(Jordan，Sandig，2014;Korkeetal.，2004;Seowetal.，2001;Butler，2005)。

因此鉴定显著影响Vero细胞粘附特性的卵白质是改变其细胞粘附特性的关键。

利用卵白质组学技术可从整体角度分析研究机体组织、细胞内的所有卵白的表达特征。

西北民族大学生物医学研究中心令世鑫高级工程师通过血清递减法筛选获得可悬浮培养的Vero细胞株，但细胞密度较低，还难于实现大规模高密度培养。

因此，本研究拟通过卵白质组学技术开端筛选Vero细胞在悬浮和贴壁培养方式下的差别表达卵白，最终筛选出与调控细胞粘附相关的核心卵白，为悬浮培养Vero细胞株的构建提供理论依据。

贴壁培养型Vero细胞解冻复苏后于细胞培养瓶在含10%新生牛血清(newbornbovineserum，NBS)的DMEM培养基(兰州民海生物工程有限公司)中。

弃去培养基后用PBS润洗，用细胞刮收取细胞至离心管中，并将细胞密度调整至1×107 cell/mL；标志后迅速生存于-80℃。

悬浮型Vero细胞(suspensioncultureVero，Sus＿Vero)由西北民族大学生物医学研究中心令世鑫高级工程师经传统血清递减法细化而成，但大规模悬浮培养时细胞密度低。

Sus＿Vero细胞在含2%胎牛血清的Vero601细胞无血清全悬浮培养基(壹生科有限公司，深圳)于三角细胞摇瓶中，37℃、5%CO2、110r/min培养箱进行孵育培养。

细胞悬液转移到1.5mLeppendorf(EP)离心管中，1000×g离心10min收集细胞，将细胞密度调整至1×107cell/mL，用预冷的PBS重悬清洗沉淀1次，1000×g离心收集细胞，弃上清液。

-80°C冻存，干冰寄送至上海欧易生物医学科技有限公司进行串联质谱标签(tandemmasstag，TMT)分析。

实验时每个样品做3个重复，样品编号为Sus＿Vero＿1、Sus＿Vero＿2、Sus＿Vero＿3、Adh＿Vero＿1、Adh＿Vero＿2和Adh＿Vero＿3。

离心后的细胞样品转移至1.5mLEP管中，将RIPA卵白裂解液和苯甲基磺酰氟卵白酶抑制剂(

phenylmethanesulfonylfluoride，PMSF)根据100∶1的比例配制好，在每支EP管中加入300μL的裂解液缓冲液，用80W功率的超声波细胞粉碎机(宁波新芝)在冰上按超声1.0s，关闭1.0s，共破碎3min。

根据卵白浓度测定(bicinchoninicacidassay，BCA)试剂盒(Ther‐moScientific，美国)对卵白质进行定量，根据BCA说明书根据bufferA∶bufferB=50∶1(V/V)配置所需体积的显色液。

取出10μg待测卵白溶液，加90μg超纯水进行稀释；准备1个干净的96孔板，根据0、1、2、4、8、12、16和20μL的梯度加入BSA尺度卵白溶液，然后每个孔加入相应体积的超纯水增补体积至20μL。

将2μL待测卵白溶液加入96孔板，每个样品设置3个复孔；各孔内加入200μL预配置的显色液，37℃反应30min后使用酶标仪进行吸光度值测定(波长562nm)。

每个样品取10μg卵白，进行SDS-PAGE电泳。

根据测定的卵白浓度，取100μg的卵白样品，加入25mmol/L二硫代苏糖醇(dithiothreitol，DTT)，混匀后在55℃孵育30min，在冰上冷却至室温后加入相应体积的碘乙酰胺，室温避光放置15min。

加入100μL四乙基溴化铵(tetraethylammoniumbromide，TEAB)复溶沉淀，加入1/50样品质量的1mg/mL胰酶Trypsin-TPCK，37℃消化过夜。

向样品中加入66μL100mmol/LTEAB缓冲液，涡流混匀，取出30μL样品于1.5mLEP管中进行标志反应。

向TMT试剂盒(ThermoScientific，美国)中加入88μL无水乙腈涡流5min，取41μLTMT试剂加到样品中，涡流混匀后室温放置1h，加入8μL5%羟胺终止反应15min后对肽段进行标志。

色谱柱：Ag‐ilentZorbaxExtend-C18(2.1mm×150mm，5μm)；流动相：溶液A含有ACN-H2O(2∶98，V/V)，溶液B含有ACN-H2O(90∶10，V/V)，流速：300μL/min，分离梯度条件见表1。

在洗脱过程中从第10分钟开始，每隔1min收集洗脱液到1～10号离心管中，根据1～10的顺序循环收取馏分，共收集10个组份。

样品收集好后在真空冷冻干燥抽干，冷冻生存待上质谱。

样本由上海欧易生物医学科技有限公司通过Q-Exactive质谱仪(ThermoFisher，美国)进行质谱分析。

一级质谱分析法(massspectrometry，MS)质量分辨率设为70000，自动增益控制值设为1e6，最大注射时间为50ms；质谱扫描设定为全扫描质荷比范围300～1600，并对其中10个最高峰进行MS/MS扫描；所有MS/MS图谱收罗使用数据依赖型的正离子模式下的高能碰撞裂解完成。

使用Tune进行校正，质谱分析的一级为全扫描，二级质谱是从一级质谱图中选择10个信号最强的多电荷母离子进行二级碎裂和质谱扫描。

利用MaxQuant数据库(https://www.maxquant.org)对质谱数据进行卵白鉴定及差别显著性判断，将其相对定量值在比力组中进行t检验，以P值作为显著性指标，当P<0.05，且差别表达量Foldchange=2时为显著上调的差别卵白，小于2则为显著下调的差别卵白。

用费希尔精确检验方法进行差别卵白GO分析以及KEGG富集分析，P<0.05时有统计学意义。

数据接纳ProteomeDiscover2.4(Thermofish‐er，美国)进行分析。

UniProt(

https://www.uniprot.org/unipro)上检索到FASTA格式的卵白列表。

用Trizol试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)从贴壁和悬浮Vero细胞中提取总RNA，使用生物光度计(Thermo，美国)丈量每个总RNA样本的浓度和OD值。

所有样品的A260/A280值在1.8～2.0之间，用核酸电泳法进一步验证纯度。

使用iScript TM cDNA合成试剂盒(Bio-Rad，美国)从每个样本中提取1mg总RNA合成cDNA，于-20℃生存，待进一步使用。

接纳Bio-RadiCycleriQ5实时定量PCR反应系统进行SYBRGreenqPCR检测，运用Prim‐erPremier5设计多配体卵白聚糖-4(syndecan4，SDC4)、肌动卵白调节器(enabledhomolog，ENAH)、肌球卵白轻链12β(myosinlightchain12β，MYL12β)、封闭卵白(occludin，OCLN)、整合素β2卵白(integrinβ2，ITGβ2)和肌球卵白轻链激酶(myo‐sinlightchainkinas，MYLK)卵白的上下游引物，以GAPDH为内参基因，引物由上海百易基因科技有限公司合成。

反应体系：PowerUp™SYBR™GreenMasterMix(2×)10μL，100μmol/L正反向引物各0.5μL，DNA模板1μL，NucleaseFree水8μL。

反应步伐：50℃2min，95℃2min，95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1min，40个循环，同时进行熔解曲线分析。

结果以"x±SE"表现，所有数据均使用Graph‐PadPrism统计软件进行分析。

按2-ΔΔCt比力Ct法计算各基因的相对拷贝数。

用GraphPadPrism9软件进行配对t检验，P<0.05时具有统计学意义。